穿山甲色谱指纹谱的建立及其在基源鉴别和质量(3)
图 3不同梯度条件下的穿山甲色谱图Fig. 3Chromatograms ofSquamaManisunderdifferent gradient conditionsColumn: Symmetry 300 C18. Mobile phase A: 0.1% (v/v) TFA in water, mobile phase B: 0.1% (v/v) TFA in acetonitrile. a. 0-40 min, 0-50%B; 40-60 min, 50%B-95%B. b. 0-50 min, 0-40%B; 50-51 min, 40%B-90%B; 51-60 min, 90%B. c. 0-50 min, 0-30%B; 50-51 min, 30%B-90%B; 51-60 min, 90%B.
2.2 对照指纹谱的建立
取12批中华穿山甲一等品,制备其供试液,按照1.3节色谱条件进行分析,采集指纹谱(见图4a)。对所有色谱图进行统一积分,将其CDF格式数据文件导入到“中药色谱指纹谱相似度系统”(2004A版),采用平均数法,时间窗设置为0.1,经多点校正和全峰自动匹配生成对照指纹谱(见图4c)。综合各一等品指纹谱出峰情况,选取出峰时间一致性较高、分离度较好的17个峰为共有峰。以共有峰的绝对面积为原始数据,计算各指纹谱与对照指纹谱间的相似度(公式(2)),如表2所示,一等品样品指纹谱与对照指纹谱的相似度均大于0.98,表明该指纹谱稳定可靠,可用于后续质量评价。
图 4(a)12批一等品、(b)12批统货穿山甲的色谱指纹谱和(c)对照指纹图谱Fig. 4(a,b ) Chromatographic fingerprints of the 24 batches ofSquamaManis(a. First-class samples, b. General samples) and (c) the reference fingerprintPeaks 1-17: common peaks.
表 2穿山甲样品指纹谱与对照指纹谱之间的相似度Table 2Similarities between sample fingerprints andthe reference fingerprint ofSquamaManisFirst-classBatch /%0.231.31
以S106批次甲片色谱图的5号色谱峰(见图4)为例考察方法的系统适应性,由图4可得到该色谱峰的塔板数大于6 000,拖尾因子为1.02,与4号峰的分离度为1.51,表明该方法的系统适应性很好。
2.4 方法学验证
处理批号为S106的穿山甲,按照1.3节色谱条件对其进行分析,系统考察方法的精密度、日内日间重复性和样品稳定性,以5号峰(见图4c)为参照峰,计算所有共有峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD值。
精密度试验中,供试品溶液连续进样6针,各共有峰相对保留时间的RSD为0.02%~0.08%,相对峰面积的RSD为0.57%~2.99%。
重复性试验包括日间重复性和日内重复性,首先平行处理6份S106批次穿山甲用于评价日内重复性,各共有峰相对保留时间的RSD为0.05%~0.12%,相对峰面积的RSD为0.46%~4.10%;连续3天,每天平行处理6份S106批次穿山甲评价日间重复性,各共有峰相对保留时间的RSD为0.05%~0.45%,相对峰面积的RSD为2.45%~4.98%。
分别于供试液制备后0、2、4、8、12和24 h将其注入液相色谱仪进行分析检测,各共有峰相对保留时间的RSD为0.23%~0.80%,相对峰面积的RSD为0.44%~4.32%,表明样品供试液在24 h内稳定性良好。
以上结果表明该方法稳定,符合指纹谱要求。
2.5 相似度评价
2.5.1不同基源穿山甲相似度评价
为了考察穿山甲指纹图谱对基源鉴定的适用性,对4种其他基源穿山甲处理并分析。将上述甲片的指纹谱与中华穿山甲对照指纹谱导入到相似度系统,指纹谱对比图见图5,其中南非穿山甲(c)和马来穿山甲(d)与中华穿山甲(e)均有很高的相似度,主观判断很难鉴别其基源。利用指纹谱系统中导出的共有峰数据,计算马来穿山甲、南非穿山甲、树穿山甲、印度穿山甲指纹谱与中华穿山甲对照指纹谱的相似度(公式(2)),相似度结果依次为0.776、0.676、0.641、0.349,相似程度均较低。因此,通过相似度评价,可以快速区分中华穿山甲与其他种属穿山甲。
图 5不同种属穿山甲甲片的色谱指纹谱Fig. 5Chromatographic fingerprints of scales from different species ; ; ; ;
2.5.2不同等级中华穿山甲相似度评价
为了考察穿山甲指纹图谱对等级鉴定的适用性,取12批中华穿山甲统货,按照实验方法对其进行处理并分析,指纹谱见图4b。按照公式(2),以共有峰的绝对面积为原始数据,计算12批统货的指纹谱与对照谱之间的相似度,结果见表2。就整体水平而言,一等品的平均相似度为0.994, RSD值为0.23%;统货平均相似度为0.988, RSD值为1.31%,一等品整体品质优于统货。对于单独个体,不同等级之间相似度存在严重的交叉现象,相似度评价难以对穿山甲质量等级作出判断。相似度评价对小类别区分的局限性在文献中多有提及,对此需要采用数据处理能力更强的方法对数据做进一步的分析。
2.6 判别分析
以12批一等品甲片和12批统货甲片的共有峰绝对面积为原始数据,质量等级为甲片标签,建立sigmoid核函数支持向量机判别模型。由十折交叉验证对模型进行训练并验证,模型的无偏差预测正确率高达为95.83%,其可视化结果见图6。由于该模型通过多维空间内的超平面对甲片进行分类,在二维平面上不能看到明显的分类界限,判别结果通过不同颜色的小球表示。其中,A、B批次甲片的模型分类结果与其甲片标签完全一致,只有S批次的S104、ST05甲片的模型预测结果与其标签不同。上述批次偏向性提示我们,模型的出错率很可能来源于人为因素造成的标签错误,而非模型自身。总之,该模型的分类能力明显高于相似度评价,其判别结果与实际等级分类高度一致,在穿山甲等级分类方面可行性很高。
文章来源:《中药药理与临床》 网址: http://www.zyylylc.cn/qikandaodu/2021/0708/648.html