腰突颗粒通过调控表达干预髓核细胞的增殖与凋(2)
1.4.3 miR-221表达检测 采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-221的mRNA表达。收集各组细胞,参照microRNA提取试剂盒说明书进行microRNA提取。提取完成后对各组样品进行反转录获得cDNA,应用荧光定量试剂与miR-221的引物进行RT-qPCR,以U6作为内参。引物序列如下:miR-221-F:GTT CGT GGG AGC TAC ATT GTC TGC,miR-221-R:GTG CAG GGT CCG AGG T;U6-F:CTC GCT TCG GCA GCA CA,U6-R:AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT 。采用 2-ΔΔCt表示各组基因 mRNA 相对表达倍数,然后做统计学分析。
1.4.4 细胞增殖检测 各组细胞采用96孔板进行培养。培养24,48,72 h后采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖。每孔加入10 μL CCK-8试剂,置于恒温培养箱中培养2 h后取出,采用多功能酶标仪在450 nm波长处检测吸光度。
1.4.5 细胞凋亡检测 采用一步法TUNEL检测试剂盒检测细胞凋亡情况。根据一步法TUNEL检测试剂盒说明书对各组细胞进行处理,细胞核采用DAPI染色,然后采用荧光显微镜进行荧光拍照,计数各组荧光表达阳性细胞与总细胞数,以阳性细胞数与总细胞数比值计算各组细胞凋亡率。
1.4.6 细胞凋亡相关蛋白检测 采用免疫蛋白印迹(Western blot)检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的蛋白表达变化。采用蛋白提取试剂盒对各组细胞进行总蛋白提取,提取过程保持在冰上操作,然后采用BCA试剂盒检测各组样品蛋白浓度,根据蛋白浓度对各组蛋白体积进行调整,使各组蛋白浓度保持一致,加入上样缓冲液后将各组样品放入100 ℃恒温培养箱中变性5 min。变性后的样品经垂直电泳、转膜、封闭后进行一抗孵育,各组均以β-Tubulin为内参,将膜置于4 ℃冰箱过夜,次日采用相应种属的HRP标记二抗进行室温孵育,孵育结束后采用ECL法显色曝光。采用ImageJ软件对各组条带进行灰度值分析,目的蛋白相对表达量为目的条带灰度值与内参条带灰度值之比。
1.5 主要观察指标 各组细胞增殖与凋亡检测;各组细胞miR-221表达;各组细胞凋亡相关蛋白表达比较。
1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0统计软件对实验数据进行统计分析,数值资料采用表示,两独立样品均数比较采用t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析,按α=0.05水准,P< 0.05为差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 miR-221模拟物和抑制剂转染髓核细胞后对细胞增殖的影响 采用miR-221模拟物及其阴性对照转染髓核细胞,CCK-8法检测细胞增殖,实验结果为数值资料,符合正态分布,方差齐,采用单因素方差分析。与正常组比较,24,48,72 h模拟物阴性对照组细胞增殖未见明显改变(P=0.805,P=0.821,P=0.460);与模拟物阴性对照组比较,24,48,72 h模拟物组细胞增殖显著减缓(P=0.028,P=0.037,P< 0.001)。采用miR-221抑制剂及其阴性对照转染髓核细胞,与正常组相比,抑制剂阴性对照组细胞在24,48,72 h 3个时间段增殖无统计学意义(P=0.975,P=0.537,P=0.545);与抑制剂阴性对照组相比,抑制剂组髓核细胞增殖明显(P=0.041,P=0.025,P=0.012)。说明在髓核细胞中miR-221影响细胞增殖活性。见图1。
2.2 miR-221模拟物和抑制剂转染髓核细胞后对细胞凋亡的作用 各组髓核细胞分别干预48 h后采用TUNEL法检测miR-221对细胞凋亡的影响,实验结果为数值资料,符合正态分布,方差齐,采用单因素方差分析。与正常组比较,模拟物阴性对照组和抑制剂阴性对照组对髓核细胞凋亡无明显影响(P=0.396,P=0.964);与模拟物阴性对照组比较,模拟物组髓核细胞凋亡显著增加(P< 0.001);与抑制剂阴性对照组比较,抑制剂组细胞凋亡率下降,差异具有统计学意义(P=0.036)。见图2。结果说明miR-221过表达时促进细胞凋亡,miR-221表达抑制时减少细胞凋亡,通过靶向调控miR-221表达的可能是延缓髓核退变的关键分子。
图 1|miR-221模拟物和抑制剂对髓核细胞增殖的影响Figure 1 |Effects of miR-221 mimetics and inhibitor on the proliferation of nucleus pulposus cells图注:与正常组比较,aP< 0.05
图 2|miR-221对髓核细胞凋亡的影响Figure 2 |Effects of miR-221 mimetics and inhibitor on the apoptosis of nucleus pulposus cells图注:图A为TUNEL绿色荧光表达、DAPI核染色及Merge重叠图(×100);B为各组凋亡率比较,aP< 0.05
图 3|腰突颗粒对髓核细胞增殖的影响Figure 3 |Effect ofYaotuGranule on the proliferation of nucleus pulposus cells图注:与正常组比较,aP< 0.05;与模型组比较,bP< 0.05
2.3 腰突颗粒对退变髓核细胞增殖和凋亡的影响 采用肿瘤坏死因子α诱导髓核细胞退变模型,腰突颗粒低、高浓度对退变髓核细胞进行干预,使用CCK-8法检测药物作用24,48,72 h细胞增殖情况。实验结果为数值资料,符合正态分布,方差齐,采用单因素方差分析。与正常组比较,模型组在24,48,72 h 3个时间段均会降低细胞增殖(P=0.023,P=0.037,P=0.002);与模型组比较,腰突颗粒低浓度和高浓度组均能促进细胞增殖(P=0.013,P=0.043,P=0.001;分析。实验结果表明,与模拟物组比较,模拟物+腰突颗粒组细胞凋亡减少(P< 0.001),细胞增殖增加(P=0.011),见图6。Western blot实验结果表明,与模拟物阴性对照组比较,模拟物组Bax蛋白表达增高(P=0.001),Bcl-2蛋白表达下降(P=0.007);与模拟物组比较,模拟物+腰突颗粒组中Bax蛋白表达降低(P=0.002),Bcl-2蛋白表达上调(P=0.003)。见图7。结果表明腰突颗粒能够下调miR-221的表达,并能逆转miR-221过表达引起的细胞增殖与凋亡的改变。
文章来源:《中药药理与临床》 网址: http://www.zyylylc.cn/qikandaodu/2021/0223/467.html