腰突颗粒通过调控表达干预髓核细胞的增殖与凋(3)
3 讨论 Discussion
目前,关于椎间盘退变的研究多以髓核细胞及细胞外基质的病理改变为主,促进髓核细胞增殖,抑制髓核细胞凋亡、早衰,促进细胞外基质的表达,对于维持髓核组织的正常形态及功能具有重要的作用,能够显著延缓椎间盘退变的发展[19-21]。越来越多的研究表明,miRNA与椎间盘髓核细胞的正常形态与功能紧密相关,如miR-499a-5p在退变髓核中P=0.001,P=0.005,P< 0.001),见图 3。TUNEL法检测腰突颗粒干预髓核退变模型后,对髓核细胞凋亡的影响。结果显示,与正常组比较,模型组细胞凋亡明显增多(P< 0.001);与模型组比较,腰突颗粒低、高浓度组均能降低髓核细胞凋亡 (P< 0.001,P< 0.001),见图 4。结果表明,腰突颗粒具有促进髓核细胞增殖,抑制髓核细胞凋亡的作用。
2.4 腰突颗粒调控miR-221表达并逆转了miR-221过表达对髓核细胞增殖和凋亡的影响 腰突颗粒干预髓核退变细胞模型48 h后,采用RT-qPCR检测各组miR-221的表达。实验结果为数值资料,符合正态分布,方差齐,采用单因素方差分析。与正常组比较,模型组miR-221 的 mRNA 表达上调 (P< 0.001);与模型组比较,腰突颗粒低、高浓度组可下调miR-221的表达水平,差异有统计学意义 (P< 0.001,P< 0.001)。髓核细胞采用miR-221模拟物转染的同时加入腰突颗粒进行干预48 h,然后检测miR-221的mRNA表达水平。与模拟物组比较,模拟物+腰突颗粒组miR-221 mRNA水平显著下调(P< 0.001)。见图5。
采用miR-221模拟物转染的同时加入腰突颗粒进行干预48 h后,检测髓核增殖、细胞凋亡及凋亡相关蛋白的表达情况。实验结果为数值资料,符合正态分布,采用两独立样本t检验进行统计下调,miR-499a-5p通过靶向SOX4发挥影响髓核细胞凋亡及髓核细胞外基质降解;上调髓核细胞中miR-129-5p的表达可促进细胞增殖,抑制细胞衰老及凋亡;在退变髓核细胞中,miR-573表达下调,采用miR-573过表达可下调Bax蛋白表达,从而抑制髓核细胞凋亡[19-21]。说明在椎间盘退变的研究中,靶向髓核细胞miRNA具有修复椎间盘的作用。已有研究显示miR-221参与椎间盘退变进程,但对其髓核细胞增殖与凋亡的作用尚不明确,因此,该研究中采用miR-221模拟物及抑制剂转染髓核细胞,以探究miR-221对髓核细胞增殖与凋亡的影响。
实验结果表明,miR-221模拟物转染髓核细胞,促使髓核细胞中高表达miR-221,CCK-8检测结果显示在24,48,72 h 3个时间段细胞增殖均减缓,TUNEL法结果显示细胞凋亡增加,说明miR-221可影响髓核细胞增殖与凋亡,为进一步验证miR-221对髓核细胞的作用,采用miR-221抑制剂转染髓核细胞,观察到细胞增殖和凋亡的改变与miR-221模拟物组相反,即miR-221抑制剂可促进细胞增殖和抑制细胞凋亡。椎间盘退变相关研究证实,椎间盘退变与髓核细胞增殖及凋亡异常改变密切相关,促进髓核细胞增殖和抑制细胞凋亡的策略具有延缓椎间盘退变的作用[25-26]。此次实验结果表明了miR-221在髓核细胞中的表达抑制了髓核细胞的增殖,促进了髓核细胞凋亡,因此靶向miR-221具有延缓髓核退变的作用。
图 4|腰突颗粒对髓核细胞凋亡的作用Figure 4 |Effect ofYaotuGranule on the apoptosis of nucleus pulposus cells图注:图A为TUNEL绿色荧光表达、DAPI核染色及Merge重叠图(×100);B为各组凋亡率比较,与正常组比较,aP< 0.05;与模型组比较,bP< 0.05
图 5|腰突颗粒对miR-221 mRNA表达的影响Figure 5 |Effect ofYaotuGranule on the mRNA expression of miR-221图注:aP< 0.05
图 6|腰突颗粒逆转miR-221模拟物对髓核细胞增殖和凋亡的作用Figure 6 |YaotuGranule rescues the effect of miR-221 mimics on proliferation and apoptosis of nucleus pulposus cells图注:图A为TUNEL绿色荧光表达、DAPI核染色及Merge重叠图(×100);B为模拟物组及模拟物+腰突颗粒组细胞凋亡率比较;C为模拟物组及模拟物+腰突颗粒组细胞增殖比较,与模拟物组比,aP< 0.05
图 7|腰突颗粒靶向miR-221影响凋亡相关蛋白的表达Figure 7 |Effect ofYaotuGranule on the expression of apoptosis-related proteins by targeting miR-221图注:与模拟物阴性对照组比较,aP< 0.05;与模拟物组比较,bP< 0.05
腰椎间盘退变继发腰椎间盘突出,引起腰背疼痛及下肢放射痛,中医认为,腰为肾之府,肝肾亏虚,腰府失养,外邪侵袭致脉络瘀阻,不通则痛,不荣则痛[27-28]。中医药在缓解腰痛症状、恢复腰椎功能方面已显示出明确疗效[29-31]。此次研究所用腰突颗粒具有补益肝肾、活血通络的功效,已在临床使用20余年。临床研究中显示,腰突颗粒能够显著缓解腰椎间盘突出症患者腰腿痛症状,治疗3个月有效率可达96.67%;动物实验表明,腰突颗粒可通过降低兔椎间盘退变模型髓核组织中Fas/FasL基因表达,从而延缓椎间盘退变;采用腰突颗粒干预人髓核细胞证实了腰突颗粒可降低髓核细胞中炎症因子的表达[16,32-33]。此次实验利用炎症因子肿瘤坏死因子α干预髓核细胞诱导髓核细胞退变模型,肿瘤坏死因子α浓度以预实验结果确定,与正常组比较,模型组中细胞增殖减缓、细胞凋亡增多,表明髓核细胞退变模型成立,与文献报道具有一致性[34]。采用腰突颗粒干预髓核细胞24,48,72 h后发现,与模型组比较,腰突颗粒低浓度组和高浓度组髓核细胞增殖明显,细胞凋亡减少,miR-221 mRNA表达下调,且呈现浓度依赖趋势,表明了腰突颗粒具有延缓椎间盘退变的作用。为了进一步明确腰突颗粒是否通过靶向miR-221发挥了促增殖和抗凋亡的作用,研究采用miR-221模拟物与200 mg/L腰突颗粒同时干预髓核细胞,发现与模拟物组比较,模拟物+腰突颗粒组细胞凋亡减少,细胞增殖增加,促凋亡蛋白Bax的蛋白表达下降,抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达增加,说明腰突颗粒逆转了miR-221过表达对髓核细胞增殖与凋亡的影响,腰突颗粒能够通过靶向miR-221发挥延缓椎间退变的作用。
文章来源:《中药药理与临床》 网址: http://www.zyylylc.cn/qikandaodu/2021/0223/467.html