基于液相色谱质谱代谢组学方法研究中药定喘汤(2)
1.2 动物实验及样本收集
动物实验设计如图1所示。将42只Wistar大鼠随机平均分为7组,分别为正常组(简写Z)、模型组(简写M)、利巴韦林组(简写L)、定喘汤组(简写D)、宣法组(简写D-X)、降法组(简写D-J)和清法组(简写D-Q),每组6只。模型组和各干预组连续3天滴鼻接种RSV(0.1 mL/只)。正常组在相同条件下连续3天接种等量生理盐水。各干预组在第1次滴鼻2 h后开始灌胃给药干预,正常组和模型组在相同条件下给予生理盐水灌胃,各组持续灌胃干预7天。其中利巴韦林组给药量为每天0.1 mL/kg的利巴韦林药液,作为阳性对照。定喘汤组及其分解剂组每天分别给予2 g/kg中药药液。取各组第0天(接种RSV前的一天)、第3天和第7天的眼底血,加入低分子肝素抗凝,以转速3 000 r/min离心5 min。取上层血浆保存在-80 ℃,用于后续的代谢组学分析。按照相同分组、感染和喂养方式处理另外两批老鼠,分别于第3天和第7天处死,提取肺组织采用实时荧光定量PCR方法[22]检测RSV mRNA表达(即病毒载量)。计算第7天处死大鼠的肺组织占体重的百分比,得到第7天的肺指数。
图 1 大鼠喂养、感染和给药过程图示Fig. 1 Schematic representation of rat feeding, infection, and dosage methodRSV: respiratory syncytial virus.
1.3 血浆样品预处理
大鼠血浆从-80 ℃取出后于冰水中融化,涡旋1 min。所有大鼠样品随机排序进行预处理与检测。处理方法如下:取50 μL血样与200 μL含内标的甲醇于96孔板孔内。室温下涡旋10 min混合均匀后静置10 min。用正压过滤的方式去除蛋白。将过滤后的提取溶液真空低温冻干,并保存在-80 ℃冰箱。每个样品用50 μL体积比为1∶4的甲醇-水溶液复溶后进行LC-MS分析。另将每个大鼠血浆取10 μL混合均匀,制备为质量控制(QC)样品。QC样品的处理同大鼠血浆样品。每检测10个大鼠血浆样品后检测一个QC样品,以评估检测过程的稳定性。
1.4 UPLC-MS条件
分析过程采用我们之前建立的液相色谱-质谱联用快速分析技术[20],分析柱使用ACQUITY UPLC BEH C8色谱柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Waters公司,米尔福德,美国)。色谱的流动相A相和B相分别为0.1%(v/v)的甲酸水溶液和0.1%(v/v)的甲酸乙腈溶液。流速为0.4 mL/min。柱温为60 ℃。进样体积为5 μL。初始梯度为95%的A相,平衡0.5 min。然后在1.5 min内线性变换至60%的A相。再之后在6 min内线性变换至0%的A相,并保持2 min。最后在0.1 min内线性变化为95%的A相,并平衡1.9 min。总的液相色谱分离时间为12 min。质谱的鞘气和气帘气压力分别为379和241 kPa。质谱扫描范围为m/z80~1 000, 信息依赖型采集(IDA)模式扫描范围为m/z60~1 000。正离子模式下,喷雾电压为5.5 kV,离子源温度为550 ℃。负离子模式下,喷雾电压为-4.5 kV,离子源温度为450 ℃。
1.5 数据处理方法
用MarkerView软件(1.2.1版本,AB SCIEX公司,康科德,加拿大)提取离子原始峰表。用80%规则[23]对离子峰表预处理,并采用内标进行校正。将在QC中RSD值小于30%的离子导入SIMCA-P软件(11.0版本,Umetrics AB公司,于默奥,瑞典)进行多变量分析,得到主成分分析(PCA)模型。将各组校正到正常组后,在IBM SPSS软件(25.0版本,IBM公司,阿蒙克,美国)中对根据实验室数据库[24]定性的150个代谢物做t检验。其中p值小于0.05的为有显著性差异。在MetaboAnalyst( Experiment Viewer软件(4.7.4版本)[25]绘制热图。
2 结果与讨论
2.1 临床指标评价
病毒载量和肺指数可监测疾病的进程,判断药物疗效。对病毒载量和肺指数数据进行独立样本t检验,考察各组大鼠与模型组之间的差异,结果见图2。如图2a、2b所示,模型组第3天和第7天的病毒载量分别为2.、1.,说明第3天RSV感染程度显著高于第7天;利巴韦林组和定喘汤组的病毒载量与相同时间点模型组比较都有显著性下降,且这两个用药组之间无显著差异;各中药分解剂组与模型组相比,清法组第3天和第7天的病毒载量显著性降低,宣法组的病毒载量在给药后的第7天也显著性减少。
图 2 各组大鼠的平均病毒载量和平均肺指数柱状图Fig. 2 Histogram of mean viral load and mean lung index of rats in each groupa. The mean viral load on day 3; b. The mean viral load on day 7; c. The mean lung index on day 7; The differences between model group and other groups were assessed by independent samplest-test, and metabolites withp<0.05 were marked by stars; Error bars indicate SD values. The letters Z, M, L, D, D-X, D-J, and D-Q represent normal group, RSV model group, ribavirin group, asthma-relieving decoction group, ascending (xuan) therapy group, descending (jiang) therapy group and pyretic clearing (qing) therapy group, respectively.
文章来源:《中药药理与临床》 网址: http://www.zyylylc.cn/qikandaodu/2021/0708/647.html
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