基于液相色谱质谱代谢组学方法研究中药定喘汤(3)
图2c表明模型组与正常组相比,第7天的肺指数显著增高。利巴韦林和定喘汤组与模型组相比,都显著降低了肺指数,且两个用药组之间并无显著差异,说明这两种药物都对RSV感染造成的肺指数增加有一定疗效。3种中药分解剂中仅宣法分解剂组显著性降低了肺指数。
2.2 代谢组学数据评价
本研究采用的是我们已建立的基于LC-MS技术的非靶向代谢组学方法,该方法能提高样品处理和分析通量,方法建立及考察过程参考文献[20]。基于非靶向代谢组学方法对正常组、模型组、利巴韦林组、定喘汤组、宣法组、降法组和清法组共计42只大鼠的血浆进行分析,在Waters ACQUITY超高效液相色谱-串联TripleTOF 5600质谱上采用正、负离子两种模式检测。正离子模式和负离子模式下分别检测到1 835和1 906个离子。QC样品中RSD值小于30%的离子累计响应分别占正、负离子模式总响应的84.9%和92.9%(如图3所示),该结果表明样品处理和检测过程稳定可靠。
图 3 (a)正离子和(b)负离子检测模式下质量控制(QC)样品的RSD值Fig. 3 RSDs of quality control (QC) samples in (a) positive and (b) negative ion modes
2.3 模式识别分析
为了从代谢物组学角度整体评价药物的药效,本研究对第0天、第3天和第7天样本数据分别建立PCA模型,得分图见图4。从图4a可以看到,第0天各组无明显分离趋势,说明造模前各组样本无差异。如图4b所示,第3天时正常组和模型组显示出明显分离趋势;模型组、清法组和降法组有聚合趋势;定喘汤组、宣法组和利巴韦林组有聚集趋势,且与模型组有明显的分离趋势,说明定喘汤、宣法分解剂与利巴韦林对RSV感染大鼠产生的代谢调控效果类似,而清法分解剂和降法分解剂对RSV感染大鼠的代谢调控不显著。通过图4b中PCA得分图显示的宣法组与定喘汤组聚集在同一区域,我们推测宣法分解剂在定喘汤的代谢调控功能中起主要作用,可能为定喘汤的主要药效来源。与第3天相比,第7天时各组与正常组间呈现明显聚拢趋势(如图4c所示),说明感染RSV第7天时,各组的代谢组趋于正常。
图 4 (a)第0天、(b)第3天和(c)第7天的主成分分析(PCA)得分图Fig. 4 Score plots of principal component analysis (PCA) of (a) day 0, (b) day 3, and (c) day 7
2.4 关键代谢物筛选及变化规律
为了排除生长、取血等过程对大鼠代谢组的影响,将各组的代谢物峰强度数据校正到相对应天数的正常组数据。为了找出感染RSV引起的代谢改变,对模型组第3天和第0天的代谢组数据进行配对样本t检验,得到并定性出83个发生显著性变化的代谢物(p< 0.05)。将这83个与RSV感染密切相关的代谢物导入MetaboAnalyst网站进行通路分析,发现多条代谢通路在RSV感染后的第3天存在明显改变,改变的通路有氨酰基-tRNA生物合成,苯丙氨酸的代谢,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,初级胆汁酸的生物合成,鞘磷脂代谢等(见图5)。
接下来我们重点关注各药物组对这83个因RSV感染而显著性改变代谢物的调节。分别对各组第3天和第7天与自身第0天的代谢组数据做配对t检验。第3天时,由于接种病毒的同时给予药物干预,与RSV感染引起的变化趋势相同且有显著性差异(p< 0.05)的代谢物则认为药物干预对该代谢物无显著性药效,否则即药物对该代谢物产生了药效。与RSV感染变化趋势相同且有显著性差异的代谢物个数总结于图6a。如图6a所示,第3天时各干预组中与RSV感染有相同变化趋势的代谢物的个数相对于模型组都大大减少,说明各给药组均可对代谢物产生药效。第7天时(如图6b所示),由于已经停止接种病毒,模型组中与RSV感染有相同变化趋势的代谢物个数减少,说明感染RSV后,即使未给予药物治疗,机体也能产生一定的自愈能力,这符合病毒感染的临床实际。而定喘汤组和利巴韦林组中有显著性差异的代谢物明显少于模型组和3个中药分解剂组,说明定喘汤组和利巴韦林组在感染第7天时对与RSV感染密切相关的代谢物产生药效,且药效优于各中药分解剂组。
图 5 RSV感染对大鼠代谢通路的影响Fig. 5 Effects of RSV infections on the metabolic pathways in rats
图 6 (a)第3天和(b)第7天时各组中与RSV感染有相同变化趋势的显著性代谢物的个数Fig. 6 Numbers of significant metabolites in each group that had similar changes with RSV infection on (a) day 3 and (b) day 7
根据配对t检验的结果,第3天时利巴韦林组或定喘汤组有药效的代谢物总共为56个。为了阐述药物治疗改变的代谢物的种类及规律,将第3天这56个代谢物校正到相对应天数正常组的相对强度显示于图7。图7中“1”表示在RSV感染后的模型组的第3天相对第0天显著性累积的代谢物;“2”表示在RSV感染后的模型组的第3天相对第0天显著性下调的代谢物;“1-a”和“2-a”表示在定喘汤组和利巴韦林组的第3天相对第0天均无显著性差异的代谢物,提示这两种药物均对这部分因RSV感染而异常的代谢物具有修正效果。“1-b”和“2-b”表示仅利巴韦林能修正的异常代谢物,它们在利巴韦林组的第3天相对第0天无显著性差异,而定喘汤对这些代谢物无明显调节作用。“2-c”表示仅定喘汤能修正的异常代谢物,它们在定喘汤组的第3天相对第0天无显著性差异,而利巴韦林无明显调节作用。“2-d”表示定喘汤和利巴韦林均可调节的代谢物,它们在感染RSV后的第3天显著性下调,在利巴韦林组的第3天相对第0天无显著性差异,但在经定喘汤干预后第3天反而显著性累积。
文章来源:《中药药理与临床》 网址: http://www.zyylylc.cn/qikandaodu/2021/0708/647.html
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